花卉PGr(花卉PGr)

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运用番茄的分子标记辅助选择有什么好处？

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番茄育种改良的实质就是对高产、抗病、抗逆、高品质等优良基因进行选择，并将其聚合到同一材料的过程。因此，最大限度地发掘和利用种质资源特别是野生种质中的优良基因，并提高目的基因的选择效率，是加快育种进程的关键。但是，番茄的重要园艺性状如产量、果实大小、颜色、硬度、果实中番茄红素、胡萝卜素、可溶性固形物的含量、风味等只有在番茄果实成熟时才能表现出来，而且对多种病害的抗性的评价贯穿在整个生育期中，加之番茄的产量、品质、抗寒性、耐弱光等重要性状均为数量性状，其表现型与基因型之间的关系又不很明确，容易受外界条件变化的干扰，依据其表现型进行的选择常常不能真实地反映基因型。因此对这些性状的评价和筛选不仅难度大，而且周期也长。

为了提高选择效率，研究者已将生物技术与常规育种结合起来。一些重要的番茄质量基因如抗病基因Tm-2、I、cf2、cf4、cf5、cf9、Cf-ECP3、Mi、Asc、Fr1、Py-1、Pto、Sw-5、Ve等、与类胡萝卜素合成途径有关的基因如y，r，B，Del，dg，hp，og，MB等（表24-4）、与番茄光合作用、呼吸作用、糖、脂肪、蛋白质、核酸合成和分解等途径有关的基因等均已获得了与之紧密连锁的分子标记，借助于分子标记，育种家可以在苗期对含有目的基因的单株进行有效的选择，大量淘汰非目的基因的单株，从而提高选择效率和准确性、缩短鉴定时间，从而加速育种进程。随着Tanksley（1992）的高密度番茄RFLP分子遗传图的发表和不断完善，以及QTL分析技术的建立，育种家操纵控制产量、品质、抗病性、抗逆性等数量性状位点（QTL）的愿望也在逐步得到实现。借助于QTL分析方法，未驯化和野生种质中大量有益的QTL得以鉴定和分离，AB-QTL（Advaced backcross QTL）分析方法的应用还实现了QTL分析和品种选育的有机结合。

表24-4 用分子标记定位的番茄抗病虫基因

表24-4 用分子标记定位的番茄抗病虫基因（续）-1

根据QTL研究成果，育种家可以利用与QTL紧密连锁的分子标记对目的QTL进行高效地选择，实现由常规育种对表现型的选择到直接地选择目的基因的巨大转变。因此QTL分析技术一经产生就受到了极大的重视，人们深信该领域研究成果的运用将为作物育种带来重大的变化。

分子标记的种类及其在番茄上的应用：基于DNA水平的分子标记广泛分布于基因组中，并具有多态性高、信息量大、重复性和稳定性好、分析效率高等优点，被广泛地用于番茄遗传和育种研究的各个方面，如种质遗传多样性分析、遗传图谱的构建、目标性状基因的标记与定位（包括质量性状和数量性状）、分子标记辅助选择以及品种纯度鉴定等。分子标记主要有以下类型：

1.RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）

Botstein（1980）等首先提出该技术，1986年Vallejos，Tanksley利用该技术获得与番茄R45s、RBCS1、RBCS2、RBCS3、CAB1，CAB2，CAB3基因紧密连锁的RFLP标记。后来Lincoln（1987）、Pichersky（1987，1988，1989）、Scharf（1990）、Rottman（1991）等利用RFLP方法进行了番茄E4，E8A，E8B，CAB6，CAB7，CAB8，HSF8，HSF24，HSF30，ACC1，ACC2，ACC3，ACC4，ACC1等基因的标记研究，并得到了相应的RFLP标记。1989年，Young和Tanksley利用RFLP标记分析了随Tm-2或Tm-2 进入L.esculentum的野生种的染色体片段。他们选择了Tm-2位点两侧的RFLP标记，对12个不同育种来源的Tm-2 和Tm-2品系进行分析，发现渗入（introgressed）基因片段最大的几乎包括染色体9的整个短臂，图距可达51cM，最短的只有4cM左右。1992年Tanksley以普通番茄和潘那利番茄杂交后代群体为基础发展了近900个RFLP标记，并建立了高密度番茄RFLP分子遗传图谱。至今仅美国康乃尔大学公布的茄果类蔬菜作物中的RFLP标记已达2330个。

2.RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）

Williams等（1990）基于PCR原理发明了RAPD技术。在番茄中Weide（1993）等利用含潘那利番茄第6染色体的普通番茄渐参系获得了第6染色体的100个特异RAPD标记，其中13个标记定位于形态学标记yv（yellow viresent）和tl（thiaminless）之间。Vander（1992），Egashira（2000）等利用RAPD方法对普通番茄和各种野生番茄进行了聚类分析，结果对番茄的分类提供了较好的证据。Rom（1995），Villand（1998），李继红（1999），蒲汉丽（2000），高蓝（2001）赵凌侠（2002）等随后利用RAPD方法进行了番茄的种质资源分析或品种纯度鉴定工作。Yaghoobi（1998）等用RAPD技术对新发现的抗线虫基因Mi-3进行了标记。在520个所用的随即引物中，找到了2个连锁标记。其中的NR14与RFLP标记TG180紧密连锁，借此，把Mi-3定位于第12染色体短臂上。由比等用了288个10个或12个碱基的RAPD随机引物，对青枯病抗病基因进行了标记，发现了4个连锁标记，有两个标记是与一个高效基因连锁。此外Ohomori（1995），Motoyoshi（1996），Pillen（1996），Dax E.（1998），田苗英（2000）等先后开展了抗番茄烟草花叶病毒基因Tm-2，Tm-2的RAPD标记工作，并获得相应的RAPD标记。

3.SSR（Simple Sequence Repeat）

Broun（1996）用GATA和GACA的重复序列进行番茄作图，结果表明重复序列在番茄基因组中并非随机分布，在着丝粒附近分布较多，作者认为这两种重复序列可以用作检测品种的多态性。Kaemmer（1995）以（GACA）4为探针进行RFLP分析，结果表明几乎每个品种都会产生独特而稳定的指纹，因此可广泛用于品种鉴定。栾时雨（1999）也得到类似的结果并建立了9个番茄品种的SSR标记。目前美国康乃尔大学公布的茄果类作物中的SSR标记已达734个。

4.AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）

Thomas C.M.（1995）利用番茄与野生种Lycopersicon pennellii种间杂交F2群体得到了42000条AFLP谱带，其中3个AFLP标记（M1，M2，M3）与Cf-9基因共分离，这3个标记位于Cf-9基因的两侧0.4cM的区域之内。用这些标记分析含有Cf-9基因的质粒，发现M1和M2标记分别位于Cf-9基因左右15.5kb的位置。最近，利用AFLP或转座子标签技术，在Cf-4，Cf-9基因附近发现了一些新的抗性较弱的抗叶霉病基因（Takken et al.，1999）。

5.SCAR（Sequence Chcterized Amplified Region）

Williamson V M（1994）获得了番茄抗根结线虫基因Mi的SCAR标记，Chague V.（1996）获得抗斑萎病毒基因Sw-5的SCAR标记。

6.共显性SCAR标记

中国农业科学院蔬菜花卉研究所鲜食番茄课题组利用SCAR标记的原理和多引物PCR技术，建立了一种共显性标记技术（Codominant–SCAR），即在获得与父本、母本基因型一致的显性SCAR标记的基础上，同时将父母本的特异引物加入到同一PCR反应体系中，得到了能同时鉴定父本、母本及其杂合体基因型的标记方法。该标记是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有重复性好、迅速、简便、低成本的特点，适合于样品的大量分析。对于鉴定农作物杂交种子的纯度、新品种审定、保护品种的知识产权等具有较大的实际应用价值。

7.STS（Sequence Tagged Site）

STS是根据单拷贝的DNA片段两端的序列设计一对特异引物，对基因组DNA进行扩增而产生的一段长度为几百bp的特异片段。由于其采用常规的PCR引物长度，其扩增结果稳定可靠。RFLP标记经过两端测序可以转化为STS。STS在基因组中往往仅出现一次，从而能够界定基因组的特异位点（Olson et al.，1989）。利用STS进行物理作图可以通过PCR或杂交的方法完成，使得物理作图方便快捷。由于STS可以作为比较遗传图谱和物理图谱的共同位点，故在基因组研究中具有重要的意义。此后K.MeKsem（2001）将10个AFLP标记进行了转化，获得了6个STS标记。

8.CAPS（Cleaved Amplified Polymorphism Sequence Tagged Sites）

CAPS同SCAR、STS等标记一样，也是一种转化RFLP、AFLP、RAPD等标记的方法，CAPS标记的特异引物经扩增后其产物的电泳谱带并不表现多态性，但用限制性内切酶对PCR产物进行消化后经电泳检测就能提示其多态性，CAPS标记揭示的是特异PCR扩增产物DNA序列内限制性酶切位点变异的信息，表现为共显性标记。在番茄中已获得抗线虫病基因Mi、抗TMV基因Tm2、抗叶霉病基因cf5、cf9，抗白粉病基因Fr1、抗细菌性斑点病Pto等基因的CAPS标记。目前，美国康乃尔大学公布的茄果类作物中的CAPS标记已有84个。

9.Multiplex-CAPS（Multiplex Cleaved Amplified Polymorphism Sequence Tagged Sites）

RFLP、AFLP具有操作复杂、时间长、需要放射性步骤和成本高等缺点，因此在构建分子图谱、分子育种及QTL分析时，为了降低成本和提高效率，一些RFLP标记、AFLP标记和COS标记被转换为CAPS标记。在将RFLP和COS标记转为CAPS标记的过程中，发现一些CAPS标记分享同一种限制性内切酶，考虑到Multiplex-PCR在同一扩增反应中应用不同引物对能同时扩增相应序列的优点以及多个CAPS标记分享同一限制性内切酶的事实，利用Multiplex-PCR和CAPS原理建立了Mutiplex-CAPS技术，该技术将Multiplex-PCR和CAPS的优点结合起来，可应用于番茄快速的遗传鉴定和分子育种中（王孝宣、杜永臣等，2003）。目前该方法已成功地用于抗番茄叶霉病基因和抗根结线虫基因的分析中。

10.SNP（Single Nucleide Polymorphism）

通过测序，然后与相关基因组中对应区域的核甘酸序列进行比较，由此可以检测核甘酸序列的差异，其中一些差异由单核甘酸的差异引起，这种遗传多态性即为单核甘酸多态性（SNP）标记。K.Meksem et al.（2001）成功地将番茄中的AFLP标记转变为SNP标记。SNP标记极为丰富，涵盖整个基因组，应用前景广阔。

总之分子标记技术的发展很快，随着生物技术的发展，将会有更多的技术被开发出来。将分子标记辅助选择技术与番茄的常规育种相结合，可提高目的性状的选择准确度和选择效率，从而加速番茄育种进程。随着番茄基因组计划的实施[Tomato Genomics Project（#9872617），（http：//www.nsf.gov/bio/dbi/dbi_pgr.htm）]，以及基因芯片技术的发展和不断完善，将为番茄饱和连锁图谱的构建提供大量DNA数据信息，并为大量群体的单株进行遗传分析提供了技术。利用番茄基因组的序列信息，可以直接对DNA序列进行比较分析，揭示个体间单个核苷酸水平上的多态性，从而发展极为丰富的覆盖整个基因组的SNP标记。利用基因芯片技术可以将分子连锁图谱上的所有基于DNA序列的分子标记（如RFLP、RAPD、CAPS、STS、SNP等）、已克隆基因的探针、EST等成千上万DNA序列固定于一个芯片上。只要将各个群体单株的DNA分别与之杂交，借助于自动化分析程序和信息管理系统，就能快速、准确、高通量地进行大量单株的遗传鉴定。随着芯片技术应用于番茄育种材料的遗传分析将有助于质量基因和QTL的精细定位和克隆，也有助于现代番茄品种改良技术、分子辅助育种技术和方法的进一步提高。